L-半胱氨酸的作用主要是还原剂，因此很多厌氧操作的实验中，加入少量的 L-半胱氨酸即可达到降低体系的氧化还原电位的作用。L-半胱氨酸之所以可以提供较低的氧化还原电位是因为 L-半胱氨酸上有一个活性的巯基(-SH)，可以和胱氨酸含有二硫键之间(-S-S-)互相转换。

由于半胱氨酸的等电点接近中性 pH，所以巯基基团通常状况下是存在的并且具有较高的活性，也因此具有很多生物功能。一些天然果汁利用了 L-半胱氨酸的这一特点在制作过程中添加少量L-半胱氨酸，使得维生素 C 不容易被氧化。

由于二硫键在蛋白质折叠过程中发挥重要作用，所以L-半胱氨酸的存在可以维持蛋白质的稳定性。L-半胱氨酸可以用于合成蛋白质、谷胱甘肽、辅酶A和其他的维持人类和生物代谢的大分子结构。在医学上，L-半胱氨酸具有消炎、止痛等作用，L-半胱氨酸盐酸盐可以用于治疗一些药物性中毒，N-乙酰-L-半胱氨酸可以用于肺病或呼吸道疾病引起的痰液粘稠、咳痰困难，其原理就是巯基能够使粘蛋白中的二硫键断裂，使痰液的粘度下降，易于咳出。

此外，还有学者证实了半胱氨酸可以促进酶与底物的结合。据《自然》杂志报道，Sdp1（一种蛋白激酶，作用于酵母分裂过程）的 His111 可以和Cys47-Cys142 二硫桥形成一个缝隙，控制底物和酶的活性中心接触。